|
|
PROBIOTICKÉ GENY POTRAVINÁŘSKY VÝZNAMNÝCH BAKTERIÍ MLÉČNÉHO KVAŠENÍ
Konečná, Jana ; Ševčovičová,, Andrea (oponent) ; Doškař, Jiří (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou různých typů magnetických částic pro extrakci DNA na pevné fázi. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Eluční podmínky DNA byly také optimalizovány. Poté byla testována bakteriální DNA a metoda použita k izolaci z reálných vzorku potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, použivána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - CHAU - V6R, poxcDNAFw - poxPromRVC, poxcDNAFw - poxPromRVT). Použitím párů primerů GroF/R a LAC2/4 byly úspěšně identifikovány druhy patřící do rodu Lactobacillus. Byly zjištěny rozdíly mezi použitými metodami extrakce z křivek tání HRM – PCR analýz.
|
|
|
Analýza DNA izolované z různých typů probiotických výrobků s využitím PCR v reálném čase a HRM analýzy
Sedláková, Lucie ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Trachtová, Štěpánka (vedoucí práce)
Cílem této práce bylo zavedení metody PCR v reálném čase s vysokorozlišovací analýzou křivek tání pro rod Bifidobacterium. V současné době je dostupné malé množství publikací, které se zabývají rozlišením kmenů rodu Bifidobacterium pomocí vysokorozlišovací analýzy křivek tání. Dle publikací, které byly zaměřeny na rozlišení bakterií mléčného kvašení, byly vybrány primery P1V1 a P2V1, LAC1 a LAC2, LsppUPF a LsppUPR, V3F a V3R, V6F a V6R. Bakteriální DNA sbírkových kmenů byla pomocí těchto primerů amplifikována metodou PCR v reálném čase s vysokorozlišovací analýzou křivek tání. Po vyhodnocení naměřených výsledků byla účinnost vybraných primerů rovněž ověřena na DNA izolované z komplexního vzorku probiotického výrobku. Po další optimalizaci by za pomoci vybraných primerů mohla být metoda PCR v reálném čase s vysokorozlišovací analýzou křivek tání vhodná i pro rod Bifidobacterium.
|
|
|
Využití molekulárně biologických technik pro identifikaci a analýzu probiotických bakterií
Konečná, Jana ; Doškař, Jiří (oponent) ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Dalším způsobem izolace DNA je použití komerčně dostupných izolačních kitů, které jsou ovšem ekonomický náročné a neposkytují vysoké výtěžky. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou typů magnetických částic pro adsorpci DNA na pevnou fázi. Magnetické mikročástice P(HEMA – co – GMA) obsahující skupinu –NH2 a nanočástice PLL, které obsahují polylysin. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Následně byly optimalizovány eluční podmínky a nakonec byla testována izolace bakteriální DNA a metoda byla použita k izolaci DNA z reálných vzorků potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě vhodné pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, která je používána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - CHAU - V6R, poxcDNAFw - poxPromRVC, poxcDNAFw - poxPromRVT). Použitím párů primerů GroF/R a LAC2/4 byly úspěšně identifikovány druhy patřící do rodu Lactobacillus. Výsledky analýzy HRM – PCR ukazují rozdíly mezi sledovanými metodami extrakce použitými pro izolaci DNA.
|
|
|
Použití vysokorozlišovací analýzy křivek tání ke studiu baktérií mléčného kvašení
Knápková, Monika ; Němcová, Andrea (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
V současné době roste zájem o užívání probiotických výrobků a na trhu je jich celá řada. S rostoucím zájmem je kladen i větší důraz na identifikaci deklarovaných probiotických mikroorganismů. Přesná identifikace mikrobiálního složení je často nelehkým úkolem a je zapotřebí pokročilejších metod, zejména z oblasti molekulární diagnostiky. Diplomová práce byla zaměřena na ověření přítomnosti deklarovaných probiotických mikroorganismů v probiotických doplňcích stravy GS Laktobacily Forte 21, Biopron 9 Premium a Linex® Forte. DNA byla z komplexních matric izolována fenolovou extrakcí, komerčním kitem a magnetickými nosiči F79/L3-PLL v kvalitě vhodné pro PCR. Následně byla izolovaná DNA amplifikována polymerázovou řetězovou reakcí v reálném čase s využitím rodově a druhově specifických primerů. Specifický PCR produkt byl podroben agarózové gelové elektroforéze, přičemž druhová identifikace nebyla vždy v souladu s údaji deklarovanými výrobci. Další část práce se zabývala polymerázovou řetězovou reakcí s vysokorozlišovací analýzou křivek tání za účelem rozlišení bakteriálních kmenů patřících do skupiny Lactobacillus a za účelem identifikace probiotických mikroorganismů přítomných ve směsi v probiotických doplňcích stravy. Bylo testováno osm sad primerů (V1F HRM a V1R-HRM, CHAU-V3F a CHAU-V3R, CHAU-V6F a CHAU-V6R, LAC2 a LAC4, LAC1 a LAC2, P1V1 a P2V1, poxcDNAFw a poxPromRVC, poxcDNAFw a poxPromRVT). Jako nejvhodnější pro rozlišení bakteriálních kmenů rodu Lactobacillus byly vyhodnoceny tři dvojice primerů (V1F HRM a V1R-HRM, poxcDNAFw a poxPromRVC, poxcDNAFw a poxPromRVT).
|
|
|
Využití molekulárně biologických technik pro identifikaci a analýzu probiotických bakterií
Konečná, Jana ; Doškař, Jiří (oponent) ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Dalším způsobem izolace DNA je použití komerčně dostupných izolačních kitů, které jsou ovšem ekonomický náročné a neposkytují vysoké výtěžky. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou typů magnetických částic pro adsorpci DNA na pevnou fázi. Magnetické mikročástice P(HEMA – co – GMA) obsahující skupinu –NH2 a nanočástice PLL, které obsahují polylysin. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Následně byly optimalizovány eluční podmínky a nakonec byla testována izolace bakteriální DNA a metoda byla použita k izolaci DNA z reálných vzorků potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě vhodné pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, která je používána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - CHAU - V6R, poxcDNAFw - poxPromRVC, poxcDNAFw - poxPromRVT). Použitím párů primerů GroF/R a LAC2/4 byly úspěšně identifikovány druhy patřící do rodu Lactobacillus. Výsledky analýzy HRM – PCR ukazují rozdíly mezi sledovanými metodami extrakce použitými pro izolaci DNA.
|
|
|
PROBIOTICKÉ GENY POTRAVINÁŘSKY VÝZNAMNÝCH BAKTERIÍ MLÉČNÉHO KVAŠENÍ
Konečná, Jana ; Ševčovičová,, Andrea (oponent) ; Doškař, Jiří (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou různých typů magnetických částic pro extrakci DNA na pevné fázi. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Eluční podmínky DNA byly také optimalizovány. Poté byla testována bakteriální DNA a metoda použita k izolaci z reálných vzorku potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, použivána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - CHAU - V6R, poxcDNAFw - poxPromRVC, poxcDNAFw - poxPromRVT). Použitím párů primerů GroF/R a LAC2/4 byly úspěšně identifikovány druhy patřící do rodu Lactobacillus. Byly zjištěny rozdíly mezi použitými metodami extrakce z křivek tání HRM – PCR analýz.
|
|
|
Použití vysokorozlišovací analýzy křivek tání ke studiu baktérií mléčného kvašení
Knápková, Monika ; Němcová, Andrea (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
V současné době roste zájem o užívání probiotických výrobků a na trhu je jich celá řada. S rostoucím zájmem je kladen i větší důraz na identifikaci deklarovaných probiotických mikroorganismů. Přesná identifikace mikrobiálního složení je často nelehkým úkolem a je zapotřebí pokročilejších metod, zejména z oblasti molekulární diagnostiky. Diplomová práce byla zaměřena na ověření přítomnosti deklarovaných probiotických mikroorganismů v probiotických doplňcích stravy GS Laktobacily Forte 21, Biopron 9 Premium a Linex® Forte. DNA byla z komplexních matric izolována fenolovou extrakcí, komerčním kitem a magnetickými nosiči F79/L3-PLL v kvalitě vhodné pro PCR. Následně byla izolovaná DNA amplifikována polymerázovou řetězovou reakcí v reálném čase s využitím rodově a druhově specifických primerů. Specifický PCR produkt byl podroben agarózové gelové elektroforéze, přičemž druhová identifikace nebyla vždy v souladu s údaji deklarovanými výrobci. Další část práce se zabývala polymerázovou řetězovou reakcí s vysokorozlišovací analýzou křivek tání za účelem rozlišení bakteriálních kmenů patřících do skupiny Lactobacillus a za účelem identifikace probiotických mikroorganismů přítomných ve směsi v probiotických doplňcích stravy. Bylo testováno osm sad primerů (V1F HRM a V1R-HRM, CHAU-V3F a CHAU-V3R, CHAU-V6F a CHAU-V6R, LAC2 a LAC4, LAC1 a LAC2, P1V1 a P2V1, poxcDNAFw a poxPromRVC, poxcDNAFw a poxPromRVT). Jako nejvhodnější pro rozlišení bakteriálních kmenů rodu Lactobacillus byly vyhodnoceny tři dvojice primerů (V1F HRM a V1R-HRM, poxcDNAFw a poxPromRVC, poxcDNAFw a poxPromRVT).
|
|
|
Analýza DNA izolované z různých typů probiotických výrobků s využitím PCR v reálném čase a HRM analýzy
Sedláková, Lucie ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Trachtová, Štěpánka (vedoucí práce)
Cílem této práce bylo zavedení metody PCR v reálném čase s vysokorozlišovací analýzou křivek tání pro rod Bifidobacterium. V současné době je dostupné malé množství publikací, které se zabývají rozlišením kmenů rodu Bifidobacterium pomocí vysokorozlišovací analýzy křivek tání. Dle publikací, které byly zaměřeny na rozlišení bakterií mléčného kvašení, byly vybrány primery P1V1 a P2V1, LAC1 a LAC2, LsppUPF a LsppUPR, V3F a V3R, V6F a V6R. Bakteriální DNA sbírkových kmenů byla pomocí těchto primerů amplifikována metodou PCR v reálném čase s vysokorozlišovací analýzou křivek tání. Po vyhodnocení naměřených výsledků byla účinnost vybraných primerů rovněž ověřena na DNA izolované z komplexního vzorku probiotického výrobku. Po další optimalizaci by za pomoci vybraných primerů mohla být metoda PCR v reálném čase s vysokorozlišovací analýzou křivek tání vhodná i pro rod Bifidobacterium.
|
host ::
RSS.